产多糖乳酸菌耐酸耐胆盐性能研究

第32卷 第3期 2016年9月 金 陵 科 技 学 院 学 报 JOURNALOFJINLINGINSTITUTEOFTECHNOLOGY Vol. 32,No. 3 Sep.,2016 产多糖乳酸菌耐酸耐胆盐性能研究 冯美琴,赵小茜,魏旭丹,陈戴玲,叶 欢 (金陵科技学院动物科学与技术学院,江苏 南京 210038) 摘 要:乳酸菌作为一种益生菌,只有具备较好的耐酸耐胆盐能力,才能到达肠道并在人体中发挥益生作用。采用测 OD600值、平板菌落计数等方法测定了4株产多糖乳酸菌的耐酸耐胆盐能力。结果表明:F604菌株的耐酸性较好; F404菌株的耐胆盐能力较好,在胆盐浓度0.3%、0.5%2种条件下培养4h后的存活率都高于对照。 关键词:多糖;乳酸菌;耐酸;耐胆盐;存活率 中图分类号:S649 文献标志码:A 文章编号:1672 755X(2016)03 0084 04 收稿日期:2016 07 18 基金 项 目:金 陵 科 技 学 院 博 士 科 研 启 动 基 金 (jit b 201301);江 苏 省 高 等 学 校 大 学 生 创 新 创 业 训 练 计 划 项 目 (201313573042X,201413573045X,201513573013Z) 作者简介:冯美琴(1975),女,江苏如东人,副教授,博士,主要从事食品微生物与生物技术研究。 AcidandBileSaltResistantAbilityof Exopolysaccharide-producingLacticAcidBacteria FENG Mei-qin,ZHAO Xiao-xi,WEIXu-dan,CHENDai-ling,YE Huan (JinlingInstituteofTechnology,Nanjing210038,China) Abstract:Asakindofgoodprobioticbacteria,LacticAcidBacteria(LAB)willhaveimportant physiologicalfunctiontopeopleonlywhenithaveacidandbilesaltresistanceandcansurvive inhumangastro-intestinaltract.Theacidandbilesaltresistantabilitiesoffourexopolysaccha- ride-producing LAB are examined with the measurement of OD600 and the plate colony counting.TheresultsshowthatthestrainofF604 hashigheracidresistantcapacity,andthe strainofF404 hasthehigherbilesaltresistantcapacitywhichshowsmorethan100% sur- vivalrateafterincubatedfor4hwith0.3% and0.5% bilesaltconcentration. Keywords:exopolysaccharides;LacticAcidBacteria;acid-resistance;bilesalt-resistance;sur- vivalrate 乳酸菌具有促进营养物质吸收、增强机体免疫力、预防和治疗疾病以及维持肠道菌群平衡等多种对机 体有益的生理功效1 3。由于乳酸菌这些独特的生理作用及其营养价值,该菌种正日益引起人们的关注, 科研工作者们也对乳酸菌的益生功效与机制展开了深入的研究。但是,人体胃液的强酸性和肠道的胆盐 可以杀死随食物进入胃内的微生物。所以乳酸菌发挥益生功效的前提是能够抵御人体胃肠道的低pH 值 和高胆汁酸盐的环境并存活下来。如果乳酸菌不能耐受胃内胃酸或肠道内的胆汁酸盐,则会影响其在人 体内的定植和益生作用的发挥4 6。所以为了确保获得的功能性乳酸菌最终能够在人体内发挥其益生功 效,就需要对这些乳酸菌的耐酸耐胆盐性能进行测定或驯化。 本研究对实验室分离、保藏的4株产胞外多糖乳酸菌的耐酸耐胆盐能力进行了测定,旨在比较各株菌 耐酸耐胆盐能力的差异,为这些益生菌株的进一步研究与应用提供理论依据。 第3期 冯美琴,等:产多糖乳酸菌耐酸耐胆盐性能研究 1 材料与方法 1.1 材料与仪器 1.1.1 材料与试剂 4株产多糖乳酸菌(F2、F404、F503、F604)由金陵科技学院动物科学与技 术学院食品系实验室分离并保藏。 MRS液体培养基,计数培养基(MRS固体培养基),猪胆盐,1molL -1盐酸,0.1molL -1氢氧化钠。 1.1.2 实验器材 SPX 30085H 型生化培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司);SW CJ 1F型 洁净工作台(上海博讯实业有限公司医疗设备厂);YM75Z型立式压力蒸汽灭菌器(上海三申医疗器械有 限公司);YK1101146型紫外可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司);pH 计(上海仪电科学仪器股 份有限公司)。 1.2 试验方法 1.2.1 耐酸试验 将4株活化好的乳酸菌按2%的接种量分别接到pH 值为2.5、3.0、3.5的 MRS液体 培养基中,37 培养箱中培养,并分别测定0、1、2、3、4、5、6、7h的 OD600值。 1.2.2 耐胆盐试验 1)低胆盐浓度时的生长情况测定。将4株活化好的乳酸菌分别接种到含0.03%猪 胆盐的 MRS液体培养基中,放入37 培养箱中培养,分别测量0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h的 OD600值。2)高胆盐浓度时的存活率测定。将4株活化好的乳酸菌分别接种到不含胆盐、含0.3%猪胆 盐、含0.5%猪胆盐的 MRS液体培养基中,37培养箱中培养4h,10倍梯度稀释后用平板计数的方法于 MRS固体培养基培养测定其活菌数,并计算存活率。 存活率/%=含胆盐的培养基中培养4h后活菌数(cfumL -1)/不含胆盐的培养基中培养4h后活 菌数(cfumL -1)100 2 结果与分析 2.1 4株乳酸菌在不同酸度下生长情况测定 在人体的众多防御机制中,胃酸对微生物存活的影响最大。人空腹时胃液里胃酸的pH 值约为2.5, 饭后胃液被稀释,pH 值上升至3.5 7。微生物从口腔进入消化道后,绝大多数因为不耐胃酸而被杀死, 只有极少数的耐酸菌能够存活下来。 本实验研究了4株乳酸菌分别在pH=2.5、3.0、3.53种酸度环境中7h内的生长情况,考察4株菌 的耐酸性,结果如图1图4所示。 通过以上4个图可以看出,4株乳酸菌的生长速度随着pH 值的增大而提高(各菌株最适pH=6.0时 培养7h的 OD600值:F2为1.37,F404为1.42,F503为1.42,F604为1.36)。pH 值为2.5、3.0时 菌株的延滞期明显延长,7h内,F2、F404及 F503在这2个 pH 下几乎不生长,F604在 pH=2.5 时几乎不生长,在pH=3.0时生长缓慢;pH=3.5时,随着培养时间的延长,4株菌逐渐开始复苏、生长。 比较4株乳酸菌在低pH 值条件下的生长情况可以看出,pH=3.5时,F503和 F604两菌株的耐酸性 能较好;pH=3.0时,菌株 F604也有一定的耐受性。 图1 F2在不同pH 条件下的生长情况 Fig. 1 ThegrowthofF2 atdifferentpHvalues 图2 F404在不同pH 条件下的生长情况 Fig. 2 ThegrowthofF404 atdifferentpHvalues 5 8 金 陵 科 技 学 院 学 报 第32卷 图3 F503在不同pH 条件下的生长情况 Fig. 3 ThegrowthofF503 atdifferentpHvalues 图4 F604在不同pH 条件下的生长情况 Fig. 4 ThegrowthofF604 atdifferentpHvalues 2.2 4株乳酸菌在不同胆盐浓度下的生长情况测定 食物在人体小肠中的停留时间一般为14h,而小肠内含有一定浓度的胆盐。人体小肠内的胆盐是 由肝细胞分泌的胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸结合而形成的钠盐或钾盐,其浓度一般在0.03%0.3%,可以 对进入小肠的微生物细胞产生高渗透压而影响细胞的存活8 10。因此实验研究了0.03%、0.3%、0.5% 3种不同胆盐浓度下4株产胞外多糖乳酸菌 F2、F404、F503及 F604的生长情况,考察4株菌对 胆盐的耐受能力。 2.2.1 低胆盐浓度下的生长情况 在胆盐浓度较低时,胆盐浓度通常对菌株的生长影响不大。实验分别 测定了4株乳酸菌在含0.03%猪胆盐的培养基中培养7h的生长情况,结果如图5所示。 图5 4株乳酸菌在0.03%胆盐浓度下的生长情况 Fig. 5 GrowthoffourLABat0.03% concentrationofbilesalt 从图5可以看出,7h内4株菌的 OD600值均有较明显的上升,说明0.03%的低胆盐浓度所产生的渗 透压较小,对4株乳酸菌的细胞活性与生长速度影响不大。其中,F404的增长速率最为明显。 2.2.2 高胆盐浓度时的生长情况 由于食物在人体内消化的时间大约为4h,所以我们设定了4h的培 养时间考察4株菌对高胆盐浓度的耐受能力。采用平板计数的方法,测定4株乳酸菌在 0.3%、0.5% 2种高浓度胆盐环境下培养4h后的活菌数,及其与不含胆盐的 MRS液体培养基中培养4h后的活菌数 的比值,并计算存活率。结果如表1所示。 表1 4株乳酸菌在不同胆盐浓度条件下的生长情况 Table1 ThegrowthoffourLABatdifferentconcentrationsofbilesalts 菌种 对照组活菌数/ (cfumL -1) 0.3%胆盐 0.5%胆盐 活菌数/(cfumL -1) 存活率/% 活菌数/(cfumL -1) 存活率/% F2 1.710 9 2.010 8 11.76 4.010 6 0.24 F404 9.610 9 3.410 10 CK 1.110 10 CK F503 8.910 10 2.810 9 3.15 1.710 5 0.0002 F604 4.610 10 2.510 5 0.0005 1.210 6 0.0026 6 8 第3期 冯美琴,等:产多糖乳酸菌耐酸耐胆盐性能研究 从表1可以看出,胆盐对不同菌株的生长有明显影响,随着胆盐浓度的增加,活菌数也随之下降。在 0.3%胆盐浓度的生长环境中,只有菌株 F2和 F404的存活率达到了10%以上,其中 F404高于对 照;当 胆 盐 浓 度 提 高 至 0.5% 时,只 有 F404 的 存 活 率 高 于 对 照,其 余 3 株 的 存 活 率 都 小 于 1%。 Bhardwaj等人研究发现将 E.faecium FH99 在 0.5% 胆 盐 浓 度 中 培 养 1h 后,其 活 细 胞 数 由 原 先 的 10 8cfumL -1下降为10 4cfumL -111 12。人体胃肠中的胆盐浓度不超过0.5%,F404的活菌数均在 10 10cfumL -1以上,满足了乳酸菌发挥益生作用的菌体浓度要求,说明菌株 F404在人体胆盐浓度范 围内可以保持较高的活性,具有较好的耐胆盐能力。 3 结 语 4株菌的耐酸耐胆盐试验结果表明,F604的耐酸性能较好,4株菌均能耐受0.03%的低胆盐浓度, F404在0.3%、0.5% 2个高浓度胆盐环境中的存活率均高于对照,活菌数均在10 10cfumL -1以上,说 明 F404的耐胆盐能力较好。 乳酸菌要发挥益生作用必须通过胃和肠道。而胃肠道的高酸度和高胆汁酸盐环境对大多数的细菌具 有杀灭作用。乳酸菌只有经受胃酸和胆盐的考验,才能保证有足够的活菌数在肠道中定植下来并发挥益 生功效。不同的菌株由于来源和自身特性的不同,对酸和胆盐的耐受性往往存在很大的差异。本研究所 用的4株乳酸菌均分离于自然发酵的泡菜中,其生长环境中含有一定的酸但不含胆盐,试验前没有经过酸 和胆盐的驯化。本次试验没有筛选出兼备良好的耐酸性能和耐胆盐性能的乳酸菌,下一步试验拟有目的 地分别对4株菌株进行耐酸耐胆盐性能的驯化,以期更好地将这些产胞外多糖的益生菌投入生产实践中。 参考文献: 1王淑梅,张兰威,单毓娟.乳酸菌与结肠癌J.微生物学报,2015,55(6):667 674 2周晓莹,陈晓琳.乳酸菌的益生作用及其应用研究进展J.中国微生态学杂志,2011,23(10):946 949 3秦晓萌,张远森,柳陈 坚,等.乳 酸 菌 胞 外 多 糖 生 理 功 能 及 合 成 途 径 的 研 究 进 展 J.食 品 工 业 科 技,2015,36(14): 389 393 4李利,孔丽,张宁,等.耐酸耐胆盐乳酸菌的鉴定及筛选J.食品科学,2015,36(21):123 128 5杨晓宇,张七斤,于晨龙,等.不同来源乳酸菌的耐酸耐胆盐试验J.动物医学进展,2014,35(2):73 77 6赵小茜,魏旭丹,陈戴玲,等.产多糖植物乳杆菌的耐酸耐胆盐能力J.乳业科学与技术,2016,39(3):1 3 7熊涛,刘妍妍,黄涛,等.副干酪乳杆菌 NCU622耐酸耐胆盐及其黏附性能J.食品科学,2015,36(5):93 98 8王记成,郭状,闫丽雅,等.益生菌LactobacilluscaseiZhang与商业益生菌对胃肠转运耐受性及发酵特性的比较J.中 国食品学报,2009,9(5):14 23 9熊涛,宋苏华,黄锦卿,等.植物乳杆菌 NCU116在模拟人体消化环境中的耐受力J.食品科学,2011,32(11):114 117 10胡爱华,敖晓琳,陈岑,等.乳酸菌耐酸耐胆盐机制的研究进展J.食品工业科技,2015,36(8):380 389 11BhardwajA,KaurG,GuptaH,etal. 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